4.对血小板聚集和凝血功能的影响:4.1.丹参酮ⅡA磺酸钠对血栓形成,血小板及凝血功能的影响:实验动物雌雄皆用,大鼠体重200±(sn)25g,小鼠体重24.0±1.4g,血样的收集:腹腔注射乌拉坦1g/kg麻醉,不论大鼠或小鼠均从颈A塑料插管取血,每次2ml左右,对照组注以生理盐水。体外血栓形成测定是按Chardle氏法测定;血小板凝集功能,采用比浊法及玻片法测定。
凝血功能测定:复钙时间(RT)、凝血酶原时间(PT)及白陶土部分凝血活酶时间(KPTT)作下述改良:25ul枸橼钠抗凝血浆置37℃玻璃平皿中,加入试剂后用针头不断挑取,记录出现丝状物时间,求2-3次的平均值。结果表明,大鼠对照组处理前和后60分钟对血栓形成、血小板及凝血功能无明显改变,静脉注射丹参酮ⅡA磺酸钠38mg/kg组在注射后60分钟,体外血栓形成时间延长、血栓长度缩短、血栓重量(湿重及干重)减轻;血小板粘附及聚集功能降低;RT、PT及KPTT延长,与给药前比较差异显着,静脉注射25mg/kg组血栓形成时间延长、血栓干重减轻、血小板粘附及聚集功能降低,与给药前比较差异显着,而RT、PT、KPTT等凝血功能只有延长倾向,静脉注射6.25mg/kg组注射后60分钟,除血小板粘附及聚集功能降低外P<0.05),血栓形成及凝血功能改变不明显,3批实验的结果基本一致,但抗凝有效量首次实验为38mg/kg,弟1次为12.5mg/kg,第2次为5mg/kg。小鼠静脉注射25mg/kg后60分钟与对照组比较亦可体现体列、血栓形成时间延长、血栓长度缩短、血栓重量(湿重及干重)减轻、血小板聚集功能降低以及PT,和KPTT延长(其中除KPTT的改变P<0.05,外,其余均P<0.01)。提示丹参酮ⅡA磺酸钠对大鼠和小鼠的体外血栓形成、血小板和凝血功能均有抑制作用,其中抗血小板作用强于抗凝血作用。
4.2.丹参素对凝血功能的影响:正常家兔15只,雄性。分为实验组(9只)及对照组(6只)。实验组耳缘静脉注射丹参注射液(每1ml含丹参素100mg)20mg/kg,对照组注射0.85%氯化钠溶液(pH4.8)。注射前及注射后30分钟、60分钟、90分钟及4.5小时,分别从心脏取血3.5ml,按文献方法进行体外血栓形成,血小板计数及血小板功能、凝血功能、纤溶活性测定。实验证实丹参素具有抗体外血栓形成,抗血小板聚集功能(ADP诱导),抗内、处凝血系统功能,减少血小板及促进纤维蛋白(原)降解的作用。这些作用在家兔1次静脉注射mg/kg后30分钟达高峰,维持1小时左右;逐步恢复。至注射后4.5小时,除体外血栓形成试验外,其余均恢复正常。
4.3.丹参素对血小板释放血管物质的影响:实验采用兔离体主动脉条生物学鉴定方法,观察了静脉注射丹参素(10mg/100g体重)前后l小时大鼠血小板释放主动脉收缩物质能力的改变。结果表明,丹参可明显抑制血小板释放缩血管物质,当大鼠静脉注射丹参素100mg/kg后,取大鼠富含血小板血浆与ADP孵胃。此孵育液可使离体兔主动脉条的收缩高度明显降低,收缩高度为0.1?mol去甲肾上腺素的38±22%,且收缩的时间也明显缩短。对照组的收缩高度可相当于0.1?mol去甲肾上腺素的107±26%,在营养主动脉条的Krebs液中加入了受体阻滞剂、抗胆碱能和抗组胺药,不加抗TXA2等前列腺素、再试验对照组的孵育液,主动脉的收缩高度达21±16mm,若给丹参素后的孵育液,收缩高度降为0.9±1.5mm,结果提示丹参素可抑制血小板TXA2的合成与释放的前列腺素类缩血管物质。另有报导,丹参注射液可抑制ADD诱导的血小板聚集:使血小板粘性降低,对抗血栓形成及凝血,也有促进纤维蛋白(原)溶解的作用。认为丹参注射液中的活性成分与血小板a受体不发生交互作用,主要通过抑制环核苷酸磷酸二酯酶的活力。增加血小板中环核苷酸,从而抑制血小板的聚集和5-MT的释放。
5.对红细胞膜的作用:将兔红细胞放入0.60%NaCl溶液中,红细胞开始破裂发生溶血,降低至0.4%时,红细胞全部破裂,溶血达最大值,试验是以0.45%NaCl溶液的红细胞溶血作为100%,在上述低渗溶液中加入丹参酮ⅡA磺酸钠0.1mg/ml,结果只有34%发生溶血,证明该药对红细胞膜有一定保护作用,丹参酮ⅡA磺酸钠不仅对低渗性红细胞膜溶血有保护作用,而且对热(50℃)、低pH、皂素性引起溶血和免疫性淋已细胞参与的羊红细胞溶血也有一定作用。结果表明,丹参酮ⅡA磺酸钠对5种方法引起的溶血均有明显的保护作用,而普萘洛尔只保护低渗性溶血,对其它4种溶血无明显对抗作用。用扫描电子显微镜观察结果表明,正常的红细胞大多数呈典型的双凹型,在0.5%NaCl溶液中,37℃保温30分钟,就见到肿胀而未破裂的红细胞和已破裂的红细胞壳,少量是类似于三磷酸腺苷耗竭的圆齿状细胞,尚见到一些表面有孔状凹陷或孔状结构的红细胞以及表面有很多起伏的细胞。在低渗溶液中加入丹参酮ⅡA磺酸钠、几乎一半以上的细胞未见破裂。保持其双凹形,圆齿状红细胞明显增多,看不到表面有孔状凹陷或小的起伏细胞,提示其保护作用是由于红细胞中肿胀程度的减轻,而不是肿胀后不破裂,可能是细胞承受切向张力增加所致。
另有报道,在体外循环中加入丹参酮ⅡA磺酸钠,可减少血细胞的破坏,实验犬分对照和给药两组,当建立起部分体外循环,转流结束即刻取血制成扫描电镜标本,结果对照组转流前的红细胞90%以上呈表面光滑的双凹圆盘形,少数为圆齿状、靶形、口形和不规则形状,部分体外循环转流后,红细胞表面圆滑性明显改变。异常红细胞明显增多。高达20%,以圆齿形和靶形的增加更为甚,给药组多数红细胞仍保持正常形态,少数红细胞表面圆滑性变差,但其程度明显低于对照组,由于体外循环转流中使血细胞成分的破坏、造成微小血栓。这对手术后脏器血液供应和恢复有密切关系。
6.对呼吸系统的作用:6.1.丹参对平阳霉素(Blromycin)引起肺纤维化的保护作用:实验用昆明种小鼠45只。体重18-20g,随机分为3组。正常对照组:不作任何处理;单纯Bleomycin:气管内注入Bleomycin、0.05ml(0.1mg),第2日起每日肌肉注射生理盐水0.05ml共l月(星期日停注1次);丹参治疗组:从气管内注Bleomycin的第2日起每日肌肉注射丹参注射液0.5ml(星期日停注1次)。注Blemycin后l月,全部处死3组动物。并分别进行各项检查:肺组织学检查(5只鼠肺)、气道灌洗收集BALF(5只鼠肺)及肺羟脯氨酸含量测定(5只鼠肺)。丹参注射液给小白鼠肌肉注射l月,观察到可明显抑制BleomycinA5所致的肺纤维化,使肺重、肺系数明显减少,肺羟脯氨酸含量明显减低,肺纤维化病变明显受到抑制,肺组织仅有少量炎症细胞浸润。可见在本实验条件下,丹参注射液对肺纤维化的保护作用是较理想的。
6.2.丹参注射液预防放射性肺损伤的作用:昆明种小白鼠,体重18-24g,共44只,随饥分组。以深部x线照射小白鼠右胸部,制成放射性肺损伤动物模型。用药组与照射前20日开始腹腔注射丹参注射液0.2ml(含生药0.16g),隔日1次,共10次,各组动物分别于照射后10日及1、3、6月分批处死小鼠、汗胸、取右肺作组织切片,HE,VanGieson染色,镜下观察,结果表明,经x线照射后,用药组的小鼠肺损伤轻、损伤修复快;而胸腺组织的改变两组无明显差别。提示丹参注射液对放射性肺损伤有预防作用。但对胸腺则无明显保护作用、作用机理可能与丹参具有提高血管内皮细胞对放射线的抵抗力,降低毛细血管通透性、改善微循环的功能有关。
6.3.丹参对大急性出血坏死性胰腺炎致肺早期损伤的保护作用:实验采用体重7.5-11kg的犬。随机分组,用5%牛磺胆酸钠1ml/kg逆行胰管注射制作ANNP(急性出血坏死性胰腺炎)模型,然后分别给予丹参(5g/kg)和生理盐水静脉滴注。结果表明,AHNP组早期PaO2,PaCO2、PH无明显改变,支气管肺泡灌注液LDH、白蛋白、LPO明显高于丹参组(P<0.05),透射镜下可见肺血管内皮细胞坏死,连续中断和血管壁缺损、而丹参组肺血管内皮细胞和肺Ⅱ型上皮细胞正常,提示丹参具有保护肺毛细血管内皮细胞和肺Ⅱ型上皮细胞作用,可能是一种氧自由茎的清除剂。
6.4.丹参对油酸性呼吸窘迫综合症的预防作用:雄性Wistar大白鼠62只。体重194.68±22.4g(sX±SD)随机分组:A组生理盐水对照组(n=10);B组油酸实验组(n-13);C组地塞米松预防组(n=13);D组丹参预防组(n=13);A组于尾静脉注入生理盐水0.1ml/kg作为阴性对照。B-D组白尾静脉于5秒内注入油酸(0.1ml/kg)。C-D组在注入油酸前15分钟,分别于腹腔注射地塞米松2mg/kg,丹参注射液1.5g/kg。B组注入油酸前不作任何处理作为阳性对照。注入油酸后6小时以断头法快速处死全部大鼠,立即取出肺组织测肺湿重。求肺系数记录肉眼改变,于左、右肺的上下部各取肺组织一块,如肺的其他部位有特殊病变及病变明显处,则病变处另取材。标本用10%福尔马林固定,石蜡包埋切片,HE染色,作光镜观察。结果表明,油酸实验组(B组)及各预防组各例肺表面虽都有不同程度的出血、充血、实化灶和梗死灶,但各预防组肺组织肉眼所见病变明显轻于实验组。如果按病变程度将散在点状病灶、边缘部病灶及边缘部伴大斑片数在病灶分别以轻、中、重三级表示、则油酸组9/13(69%)表现为重度改变,而各预防组中仅丹参组出现1例重度改变,占丹参组8%;油酸组无一例表现为轻度改变,预防组C-D组的轻度改变分别为5/13(39%),4/13(31%)和3/13(23%),其余均表现为边缘部病灶为主。病变以边缘部最为明显,可能与末梢动脉栓塞、痉挛有关。肺系数结果显示油酸组肺系数明显大于各预防组,经统计学处理差异非常显着(P<0.01),而各预防组之间比较无显着性差异(P<0.05)。光镜观察可见预防组病理程度及检出率小于油腻组。与地塞米松的预防效果相似。认为早期预防性应用丹参可以减轻或预防呼吸窘迫综合症(RDS)的发生。
7.对血脂和动脉粥样硬化斑块形成的作用:7.1.丹参素对内源性胆固醇(Ch)合成的抑制作用:两性霉素B可与动物细胞膜上的Ch形成复合物,可使细胞膜上出现微孔,进而导致细胞死亡。在缺乏外源性Ch供给的条件下,若应用Ch合成抑制剂抑制内源性Ch的合成则可阻止上述复合物的形成,使细胞免受两性霉素B的杀伤作用,因此实验预先用含LPDS的培养液孵育细胞,使细胞处于无外源性Ch供给的条件下,此时将细胞分为3组,第1组不加Ch合成抑制剂、第2组加已知的高效Ch合成抑制Mevin-olin(6umol),第3组加入不同浓度的丹参素,结果发现第1组细胞几乎全部死亡,而第2、3组细胞形态基本正常,第3组细胞加入不同浓度丹参素后,MTT反应所测得的OD值大小与丹参素浓度在10-100ul/孔浓度范围内呈量效关系(1/=0.023±0.00007x,r=0.97),即与存活细胞数之间呈正比关系。
7.2.丹参素对氧化低密度脂蛋白(LDL)生成的影响:根据Wieland的方法改良制备,加丹参素制备的氧化LDL称之丹参素-OLDL;不加丹参素等抗氧化剂制备的氧化LDL称之OLDL,加维生素E制备的氧化脂蛋白称之维生素E-OLDL。按Schuh等人的方法测定,Ex515nm,Em553nm。结果表明,天然LDL(NLDL)及丹参素-OLDL的电泳迁移率均小于OLDL且有显着性差异(P<0.05),而丹参素-OLDL与NLDL相比无显着性差异(P>0.05)。各种LDL中脂质过氧化物(以MDA表示)含量见表18,丹参素-OLDL中MDA含量显着低于)LDL组,丹参素-OLDL中MDA含量稍低于VE-OLDL组,但二者无显着性差异,提示丹参素可用于动脉粥样硬化的防治。
8.抗菌、消炎作用:8.1.总丹参酮的抗菌作用:在体外抗菌试验中发现,丹参的乙醚提取物总丹参酮对金黄色葡萄球菌和其耐药菌株有较强的抑菌作用。总丹参酮中含有10个单体成分,分别进行抑菌试验,其中隐丹参酮、二氢丹参酮Ⅰ、羟基丹参酮Ⅱ-A、丹参酮ⅡB和丹参酸甲酯有抑菌作用。丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、丹参新醌甲、乙和丙无抑菌作用。总丹参酮对临床分离出的8株耐青霉素、链霉素和金霉素的金黄色葡萄球菌和50株耐红霉素金黄色葡萄球菌亦均敏感。总丹参酮的最低抑菌浓度(62.5ug/ml)比小檗碱最大浓度(500ug/ml)的抑菌力还强。总丹参酮及其单体对人型结核杆菌H37RV均有不同程度的抑菌效果,尤以丹参新醌甲的效果为最强。从化学结构与抑制人型结核菌活性关系的研究结果表明,属菲醌类的丹参酮Ⅰ、属邻醌类的隐丹参酮和介于两者之间的丹参酮ⅡA,均有较强的活性。认为二萜醌类成分的抑菌作用需要有一定的脂溶性。若母核上引入极性基团则活性降低。总丹参酮在25-50ug/ml浓度时,对铁锈色毛发癣菌和红色毛发癣菌也有抑制作用。以金霉素的阈下治疗量和2%总丹参酮悬液0.5ml合并应用。表明丹参酮可以加强金霉素对金黄色葡萄球菌感染小鼠的保护作用。
8.2.丹参酮对大白鼠关节肿的抑制作用:8.2.1.对大白鼠蛋清性关节肿的影响:体重200-230g雄性大白鼠20只,随机分成两组:给药组每只灌胃2%丹参酮混悬液2.0ml;对照组给等量的淀粉悬液。实验前l日,预防给药2次,间隔7小时。给药后l日预防给药2次,间隔7小时。给药后l小时向大鼠右后足掌皮内注入新鲜蛋清0.1ml,注射后立即测量左侧踝关节周长。在注入蛋清后1、2、3、4、5和6小时各测量一次肿胀的右踝关节周长,左右周长之差为肿胀程度,在各时间内两组进行统计学比较,结果说明丹参酮有明显地抑制大白鼠蛋清性关节肿的作用。
8.2.2.对大白鼠角叉菜胶关节肿的影响:体重170-220g雌性大白鼠20只,随机分成两组。给药组在实验前预防给2%丹参酮悬液两日,每天2次,间隔7小时,每只每次灌胃2.0ml。对照组给等量的淀粉悬液。实验当日给药后30分钟向大白鼠右后足掌皮下注射l%角叉菜胶0.1ml,注入致炎剂后立刻以排水法测量左足的体积,致炎后1、2、3、4、5和6分钟各测量右足体积一次,在第3小时测时后再给药1次,给药组与对照组进行统计学比较。结果表明,丹参酮对角叉菜胶引起的大白鼠关节肿有明显的抑制作用,所测各时间结果都有统计学意义。
8.2.3.对大白鼠右旋糖酐关节肿的影响:体重170-200g雌性大白鼠20只,随机分成两组。给药方法同角叉菜胶关节肿的实验。每鼠右后足掌皮下注射6%右旋糖酐0.1ml致炎,致炎后1、3、5和7小时重测大白鼠右后足体积,以各时间的右足体积减去左足体积为肿胀程度,两组肿胀程度在1、3、5和7小时内比较有统计学意义,说明丹参酮对右旋糖酐所致大白鼠关节肿有明显的抑制作用。
8.2.4.对大白鼠甲醛性关节肿的影响:体重180-230g雌性大白鼠20只,分成两组。给药方法完全同角叉菜胶关节肿实验。致炎剂为2.5%甲醛0.1ml。致炎后1、3、5、7、24、48、72及96小时各测1次右足体积。结果表明:1小时两组没有明显差别,3、5、7、24及48小时各时间内两组差别均有明显的统计学意义。72小时对照组己开始自行恢复,96小时恢复更迅速。说明丹参酮对甲醛所致亚急性关节肿有明显的抑制作用。
8.2.5.对大白鼠感染性关节肿的实验治疗作用:雄性大白鼠,体重120-160g,每组10只。菌液和药物均同小白鼠实验治疗项。将培养18小时菌液做1:1稀释后备用。于实验前1日,分组后灌胃给药2次,间隔6小时,每次每只2ml。实验当天早晨再灌胃给药2ml,l小时后取0.1ml制备的菌液皮内注入大白鼠左脚掌,3小时后测量关节周长,将给药组与对照组进行统计学处理,结果表明,总丹参酮对大白鼠感染性关节肿有较明显的抑制作用。
8.3.丹参注射液对角叉菜胶致大鼠足跖部水肿的抑制作用:Wistar大白鼠,体重180-250g,分为两组。治疗组肌肉注射丹参注射液1ml,30分钟后于足跖部皮下注入1%角叉菜胶0.1ml,对照组肌肉注射等量生理盐水。结果可见丹参注射液可使水肿明显减轻,肿胀抑制率达51%。
8.4.对大白鼠甲醛性腹膜炎的影响:体重170-200g雄性大白鼠20只,分成两组。每鼠腹腔注入2%甲醛液1.0ml,36小时后处死,抽出腹腔渗出液并记录液量。两组进行统计学处理。给丹参酮组于注入甲醛前30分钟给药1次。次日再给药2次,间隔7小时。结果表明:丹参酮对甲醛所致的大白鼠腹膜炎有明显的抗渗出作用。丹参的抗炎作用机制不甚清楚,有人报道丹参注射液对大鼠中性粒细胞趋化性明显减低,并抑制溶酶体酶的释放,可能是丹参抗炎作用环节之一。另有报道,用人白细胞与总丹参酮共同孵育l小时,可明显抑制白细胞趋势化性(Chemotaxia,即白细胞向趋化因子方向移动的有方向的运动),而对白细胞的随机运动(Randommotility,即白细胞所固有的不受趋化因子影响的无方向的运动)无影响。若延长孵育时间至19小时,则5ug/ml的总丹参酮已足以明显抑制白细胞趋化性及随机运动,抑制率分别为79和81%。这一结果与丹参酮明显抑制体内白细胞向炎症区的游走相一致。另从丹参酮的大鼠血中所测定PGF2a和PGE水平明显降低,进一步揭示了丹参的抗炎机制。
9.对肝细胞损伤的保护作用:9.1.丹参对实验性肝再生的影响:实验动物为大白鼠,体重180-220g,雌雄兼用。动物分为两组。于实验第1日上午9-11小时,除正常组外,全部动物在乙醚麻醉下,行部分肝切除术,切除肝脏左叶及中叶(约占肝重68%),称重。术后当天下午及次日上午给药组分别给药,经皮下注射1ml/只。实验第44小时,腹腔注射秋水仙碱1ml/只(含0.2mg)、48小时,全部处死动物。取血清作谷丙转氨酶(SGPT)测定(改良金氏法),应用反向血凝法检测甲胎蛋白(AFP)。称肝重,计算再生度。取小块肝组织固定于10%福尔马林液,石腊包埋,苏木素-伊红染色,镜检作组织学观察,并计算核分裂指数。实验结果表明,丹参可使肝再生度、核分裂相指数、AFP检出率均增高,说明丹参具有促进肝再生的作用。至于其作用机理,可能与丹参改善血液循环的作用有关。在全身及局部组织血液循环改善的基础上,使门脉血流增加,改善肝脏供血和营养,可能是促进肝脏再生的重要因素。肝脏再生受到多种激素的调节,尤其是胰岛素和胰高血糖素具有明显促进肝再生的作用。丹参等活血化瘀药物改善血液循环。同时可带来较多的胰岛素和胰高血糖素,在促进肝再生中亦可能有一定作用。
9.2.丹参对大鼠急性肝损伤的作用:取大白鼠,体重200-260g,雌雄兼用。实验分组进行。即正常组、肝损伤组以及丹参给药组,各组8只大鼠。实验第1、5日除正常组外,其余2个组均皮下注射四氯化碳0.5ml/100g体重,自实验第2日起各治疗组动物开始给药,肝损伤组给以等量生理盐水。实验第7日下午6小时全部动物禁食,次晨6小时以50%葡萄糖灌胃,每只动物2ml。2小时后处死动物,迅速切取部分肝脏作糖原和甘油三酯测定;其余肝脏部分分别用10%福尔马林液固定,进行苏木精一伊红染色(HE)和用Carnoy液固定,PAS法显示糖原。取血清进行谷丙转氨酶(SGPT)和B脂蛋白测定。经统计学处理,丹参组较肝损伤组SGPT活力明显降低(P<0.01);肝内甘油三酯含量与肝损伤组相比较,仅丹参组有明显降低(P<0.05);血清B脂蛋白测定结果表明,各给药组与肝损伤组相比均无明显差异。给药组肝匀浆糖原含量与肝损伤组相似(P>0.05)。组织化学染色所显示的肝糖原含量与上述测定结果大体一致。病理组织学观察亦表明,丹参可明显减轻肝坏死和炎症反应(P<0.05和P<0.01)。
9.3.丹参对实验性肝硬变的防治作用:取大白鼠,体重200-320g,雌雄兼用,按前述实验分组。除正常组外,各组均饲单纯玉米面,混以0.5%的胆固醇(前2周加猪油20%),以30%乙醇为饮料。于实验第1日,除正常组外,其余各组每只动物皮下注射四氯化碳0.5ml/100g体重,以后每隔3日皮下注射油剂四氯化碳(40%植物油溶液)0.3ml/100g体重。从实验第5周开始,给药组分别给予中药,对照组给等量生理盐水,至第9周末处死动物。取血清作蛋白电泳分析、SGPT及胎儿甲种球蛋白(AFP)检测(反向血凝法)。取肝脏左叶固定于10%福尔马林液中,作苏木精一伊红染色(HE)及胶原纤维染色(VG);其余肝脏部分留作羟脯氨酸测定,以求胶原蛋白含量。实验结果表明,丹参给药组能明显降低胶原蛋白含量(P<0.01)及血清r球蛋白含量。羟脯氨酸是胶原降解的产物,经尿排出,因此测定尿羟脯氨酸量可反应肝内胶原降解的速度。
另有实验结果表明,经丹参治疗3周后,大白鼠尿羟脯氨酸排泄量明显高于对照组,间接证明丹参可促进胶原纤维的降解。体内胶原分解主要是通过胶原酶的作用,在中性环境中,经胶原酶作用,可将胶原蛋白裂解为两部分,一部分为大的3/4,一部分为小的1/4,裂解后的碎片,再经非特异性蛋白酶作用逐渐分解。因此,胶原降解的关键与胶原酶的作用密切相关。丹参促进胶原降解可能是通过增加胶原酶的产生或增强胶原酶的活性而实现的。
9.4.丹参对肝纤维重吸收的作用:实验取大白鼠23只,体重170-210g,雌雄兼用,分成肝硬化对照组。给药组及正常对照组。实验第l日,前两组动物皮下注射四氯化碳40.5ml/100g体重,以后每隔3日皮下注射油剂四氯化碳(40%植物油溶液)0.3ml/100g体重。单纯玉米面(前2周加入20%猪油)加入0.5g%胆固醇为饲料,30%酒精为唯一饮料。实验第9周,撤除上述全部病因刺激,恢复正常膳食及饮水,给药组开始给药,肝硬化对照组给生理盐水。于给药后1、2、3周末收集各组动物16小时尿,测定尿羟脯氨酸含量。于实验第ll周末断头处死全部动物。制片用JEM100CX型电镜观察。其余肝组织留作肝羟脯氨酸测定,以计算肝胶原蛋白含量。实验结果表明,经丹参治疗的动物,肝纤维化较对照明显减轻,且肝脏胶原蛋白含量亦明显低于对照组。说明药物有促进肝纤维重吸收的作用。至于丹参减轻肝纤维化的机理尚不清楚,就现有资料认为,丹参抑制纤维增生与丹参促进坏死肝细胞的修复和及时再生有关。
9.5.丹参注射液对大鼠部分肝切除后肝脏再生的影响:取雌性Wistar大白鼠,体重140-190g,饲以一般饮食,手术前后不禁食水。术前称体重,在轻度乙醚麻醉下行肝左时及正中叶切除术,并将切除之肝脏称重。手术均在上午8:30-11:30之间进行。术后动物随机分为6组:用药组按术后处死时间24、48及72小时分为3组,对照组亦按处死时间分为3组。于述后当日起,每天下午4点给各用药组动物腹腔注射丹参注射液0.66ml/只。分别于手术后24小时、48小时及72小时将各组动物在乙醚麻醉下处死。取出全部残留肝脏,观察丹参注射液对大鼠部分肝切除后肝脏DNA合成率、DNA含量、肝细胞标记核数、肝细胞分裂相以及再生肝重变化的影响。实验结果表明丹参注射液能够促进肝脏再生时的DNA合成和细胞分裂增殖过程,具有一定的促进肝再生作用。丹参的这种作用可能是通过改善肝脏局部血液循环,加强肝再生内在因素的作用而实现的。
戚心广等观察了丹参等对实验性肝损伤大鼠的肝细胞的保护作用,通过肝损伤大鼠肝的光镜及电镜的病理变化及其血浆纤维联结蛋白水平的消长,显示出丹参可以刺激大鼠血浆纤维联结蛋白(PFN)水平的升高,从而提高其网状内层系统的吞噬功能及调理素活性,防止肝脏的免疫损伤,达到保护肝细胞和促进肝细胞再生的作用。近年来,许多学者证实血浆PFN是单核-巨噬细胞系统的主要调理素,其主要功能之一是作为网状内皮系统吞噬作用的一种介质,对内毒素及许多损肝因子有调理作用。提示丹参不单纯是改善肝脏微循环,供给肝脏有益因子,更重要的是丹参可以提高PFN水平,增强网状内皮系统吞噬功能和调理素活性,避免肝脏免疫损伤,最终起到保护肝细胞和促进肝细胞的再生作用。
10.促进组织修复和再生的作用:10.1.丹参注射液对小鼠骨折愈合中钙沉积的影响:实验用成年雄性健康小鼠。体重25-35g,以45Ca沉积量为指标观察骨形成的速度。用自制骨折器造成小鼠右股骨中段闭合骨折,骨折后每天给予丹参注射液0.5ml(口服)。给药后5、7、9、13分别处死小鼠。处死前48小时尾静脉注射0.2ml45Ca一氯化钙溶液,测定左右股骨及右胫骨上、中、下三段的放射活性。结果发现正常小鼠,左右骨相应部位钙沉积相似;右股骨中段骨折后,生理盐水组与丹参组小鼠的中段股骨钙沉积不断升高,而股骨上、下二段反而下降,丹参组下降更显着。说明丹参可以从邻近骨组织中调动比生理盐水更多的钙,以更好的满足新骨形成对钙的需要,从而使骨折愈合加速。
刘季兰等采用C57BL纯种成年健康小白鼠,观察了丹参注射液对小鼠骨折愈合中钙再吸收的影响。结果表明,正常小鼠左右股骨及胫骨上段的放射活性均随时间而不断下降;注射45Ca后不同时间造成右股骨中段骨折后,生理盐水组小鼠骨折部位的放射活性却低于相应健侧;丹参组小鼠中这种变化变得更为显着。通过电子显微镜观察,发现使用丹参注射液后,可使家兔骨折部位骨痂形成提前,且更为致密。骨生成细胞分布部位及数量增加;成纤维细胞除有外形改变外,细胞的蛋白质合成活动更为旺盛,细胞的正常变性过程也加快,细胞外胶原纤维增多,并进入成纤维细胞的胞质内;有增多的破骨细胞出现在不同的骨痂部位,促进骨的改建,另外,成纤维细胞肿胀的线粒体内出现众多的致密钙颗粒,从而使骨痂有更多更早的钙盐沉积。家兔前肢桡骨骨折实验中也证明丹参可促进骨折愈合。
10.2.丹参注射液对鸡胚额骨分离细胞培养生长的影响:鸡胚额骨分离细胞的制备,采用孵育12日的Leghorn鸡胚额骨(除去骨外膜),经剪碎清洗、胰酶消化后过滤,滤液即为鸡胚额骨分离细胞悬液。经细胞计数总共获得约3x103个细胞。用EagleMEMNissui(1)培养液,简称Eagle培养液(含20%小牛血清)稀释至10ml,分装于5个培养瓶内(瓶内预先各放2条载玻片条),每瓶2ml。然后分别再加Ea-gle、0.8%丹参Eagle、0.4%丹参Eagle、0.2%丹参Eagle及0.1%丹参Eagle培养液各2ml。分别称为对照组和0.8、0.4、0.2及0.1丹参组5组,在38℃二氧化碳培养箱内培养。每周各换相应培养液3次,逐日用倒置显微镜观察。培养至26日标本被收获,分别染色,和碱性磷酸酶-酸性磷酸酶反应(简称Alp-Acp反应),作各组间比较。实验结果表明,丹参能促进骨细胞样细胞成熟,分泌胶原性物质和AIP,并使钙盐在胶原基质上沉积,形成骨小结节。但是浓度过高能导致对成骨细胞样细胞生长的抑制。
10.3.丹参对家兔皮肤切口愈合的影响:实验用体重为2-3kg的雄性家兔,分对照组;和为丹参组。所有家兔右上肢用电剪剃毛,在戊巴比妥钠静脉麻醉(30mg/kg)及无菌技术下作右前壁中下1/3部位掌面皮肤全层纵行切口,长约1.5cm,皮肤切口作间断缝合。手术当天起对照组每天肌肉注射生理盐水2ml。丹参组每天注射同一批号丹参注射液2ml。注射最多不超过13针,宰杀当天停止注射。对照组于术后1-10日以及17、21、25、30日各取家兔2只作系列观察;用药组于述后第1、3、5、7、9、13、17、21、25、30日各取家兔2只作组织学和组织化学对比观察。结果表明,丹参组的巨噬细胞及成堆异物巨细胞的出现均早于对照组,使创伤修复的清扫阶段明显提前,持续出现丰富而充血的毛细血管,另外,丹参组的血管性肉芽组织、胶原性肉芽组织以及疤痕性肉芽组织的出现均于显着早于对照组,说明由于应用丹参产生了活血化瘀作用,促进了皮肤切口愈合。
丹参的活血化瘀作用可促进组织修复和再生,如加快骨折和皮肤创伤的愈合都可能与它的改善微循环障碍和血液流变学等作用有关,致使局部血流供应增多和营养增加,促进组织的修复和再生。还可能通过内在调节机制而影响机体的反应性。
11.抗肿瘤作用:11.1.丹参对大鼠Walker256癌细胞血行播散的影响:取年幼健康大鼠,体重65-85g,雄性。每支丹参注射液2ml含生药3g。用Walker256癌细胞腹水型,在无菌条件下,抽取少量癌性腹水,经血球计数仪计数后,用生理盐水稀释成1-3X105/0.2ml浓度。于大鼠尾静脉注射l-3X105个Walker256癌细胞